Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Caracterización de la heterogeneidad transcripcional de targets terapéuticos en leucemia linfoblástica aguda pediátrica mediante secuenciación de lectura larga |
| Título alternativo: | Characterization of transcriptional heterogeneity of therapeutic targets in pediatric acute lymphoblastic leukemia using long-read sequencing |
| Autor: | Viappiani, Lucila |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
|
| Publicación en la web: | 2026-07-08 |
| Fecha de defensa: | 2025-12-16 |
| Fecha en portada: | Diciembre 2025 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Biológica |
| Director: | Ruiz, María Sol |
| Jurado: | Petrillo, Ezequiel; Almejún, María Belén; Sananez, Inés |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001862_Viappiani |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001862_Viappiani.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001862_Viappiani |
| Ubicación: | BIO 001862 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Viappiani, Lucila. (2025). Caracterización de la heterogeneidad transcripcional de targets terapéuticos en leucemia linfoblástica aguda pediátrica mediante secuenciación de lectura larga. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001862_Viappiani |
Resumen:
La Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) es el cáncer más frecuente y la principal causa de mortalidad oncológica en niños/as menores de 15 años a nivel mundial y en Argentina. La enfermedad presenta una marcada heterogeneidad genética y transcripcional, y a pesar de avances en el tratamiento, la recaída sigue siendo la causa principal del fracaso terapéutico. Las tasas de supervivencia a cinco años en Argentina (73,7%) se encuentran por debajo de las reportadas en países de altos ingresos (>90%), resaltando la importancia de fortalecer las estrategias de abordaje diagnóstico y terapéutico en el contexto local. En este contexto, las inmunoterapias dirigidas contra antígenos de superficie como CD19, CD22 y CD20 (codificado por el gen MS4A1) han mejorado significativamente el pronóstico de pacientes con enfermedad refractaria o en recaída, ampliando las opciones terapéuticas en situaciones donde la quimioterapia convencional resulta ineficaz o asociada a excesiva toxicidad. Sin embargo, la eficacia de estas terapias está comprometida por la resistencia adquirida, a menudo vinculada a la pérdida o alteración de epítopes. La secuenciación de lectura larga, como la tecnología Oxford Nanopore Technologies (ONT), permite secuenciar moléculas completas, facilitando la identificación precisa de isoformas transcripcionales generadas por splicing alternativo, algo que es un desafío para la secuenciación de lectura corta (Illumina). La hipótesis del proyecto que enmarca esta tesis es que las características genéticas del clon leucémico al momento del diagnóstico, combinando el subtipo molecular y la diversidad de isoformas transcripcionales del gen MS4A1, determinan la respuesta terapéutica a rituximab en combinación con quimioterapia estándar en pacientes con LLA-B pediátrica (actualmente en evaluación en el protocolo clínico ALLIC-BFM-2022). En particular en esta tesis el objetivo general fue desarrollar y optimizar un flujo de análisis bioinformático para la caracterización de isoformas transcripcionales en LLA-B pediátrica mediante ONT, evaluando su aplicabilidad para la detección de isoformas anotadas y novel de genes blanco de inmunoterapia. En el marco del protocolo clínico ALLIC-GATLA-2010, se analizaron muestras de médula ósea de dos pacientes pediátricos (HNG002 y HNG003) obtenidas al diagnóstico. El ADNc de las mismas se secuenció mediante tecnología ONT, tanto transcriptoma completo como amplicones de MS4A1 y CD19, y los resultados se compararon con datos previamente generados mediante secuenciación Illumina. La cobertura horizontal en MS4A1, CD19 y CD22 obtenida con ONT fue similar a la de Illumina en las regiones codificantes, con mayor variabilidad en la región 3’UTR e intrones. Aun con una profundidad de secuenciación ~3-5 veces menor, los perfiles globales de expresión génica mostraron una correlación alta entre tecnologías, con r> 0,7 tras excluir outliers, indicando consistencia en los perfiles transcriptómicos. Esta consistencia se reflejó en la clasificación molecular del tumor, donde ambas tecnologías coincidieron en el subtipo asignado a cada muestra (Ph-like, PAX5alt). Sin embargo, se observaron diferencias en la cuantificación de isoformas individuales entre plataformas, incluyendo un cambio en la isoforma predominante para MS4A1 y CD19. La cuantificación de isoformas de lectura larga varió según la herramienta utilizada, lo que subraya la necesidad de estandarizar metodologías para el análisis de isoformas específicas. La secuenciación de amplicones permitió detectar una isoforma de MS4A1 (ENST00000528313.1) que carece del exón codificante del epítope de unión a rituximab, la cual no había sido capturada en el transcriptoma completo y su presencia en las muestras fue validada mediante RT-PCR. El conjunto de isoformas novel identificadas presentó bajo solapamiento entre las 2 herramientas utilizadas. La predicción estructural in silico de la isoforma novel más abundante identificada con la herramienta FLAIR para MS4A1 predice una proteína truncada con la pérdida completa de una porción expuesta en superficie. Aplicamos por primera vez en Argentina la secuenciación del transcriptoma completo mediante lecturas largas con ONT en Argentina. La alta variabilidad entre herramientas bioinformáticas resalta la importancia de estandarizar los flujos de análisis bioinformáticos para asegurar la reproducibilidad. Este trabajo estableció una base metodológica para evaluar de forma prospectiva la asociación entre el perfil de isoformas transcripcionales y la respuesta a rituximab en combinación con quimioterapia en el marco del ensayo clínico multicéntrico ALLIC-BFM-2022 y contribuir a la implementación de nuevas tecnologías para la clasificación de subtipos moleculares de LLA en Argentina.
Abstract:
Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common cancer and the leading cause of cancer-related mortality in children under 15 years of age worldwide and in Argentina. The disease exhibits genetic and transcriptional heterogeneity, and despite therapeutic advances, relapse remains the primary cause of treatment failure. Five-year survival rates in Argentina (73.7%) remain below those reported in high-income countries (>90%), underscoring the importance of strengthening diagnostic and therapeutic strategies within the local context. In this scenario, immunotherapies targeting surface antigens such as CD19, CD22, and CD20 (encoded by the MS4A1 gene) have significantly improved the prognosis of patients with refractory or relapsed disease, expanding therapeutic options in situations where conventional chemotherapy becomes inefficient or associated to excessive toxicity. However, the effectiveness of these therapies can be compromised by acquired resistance, often associated with the loss or structural alteration of epitopes. Long-read sequencing technologies, such as Oxford Nanopore Technologies (ONT), enable full-length RNA molecule sequencing, facilitating the precise identification of transcript isoforms generated through alternative splicing, a challenge for short-read sequencing (Illumina). We hypothesize that the genetic characteristics of the leukemic clone at diagnosis, combining molecular subtype and the diversity of MS4A1 transcript isoforms, determine the therapeutic response to rituximab in combination with standard chemotherapy in pediatric B-ALL (currently under evaluation in the ALLIC-BFM-2022 clinical protocol). The general objective was to develop and optimize a bioinformatic workflow for transcript isoform characterization in pediatric B-ALL using ONT, evaluating its applicability for the detection of annotated and novel isoforms of immunotherapy target genes. Within the framework of the ALLIC-GATLA-2010 clinical protocol, bone marrow samples from two pediatric patients (HNG002 and HNG003) obtained at diagnosis were analyzed. cDNA from these samples was sequenced using ONT technology (both whole-transcriptome sequencing and targeted amplicons of MS4A1 and CD19) and results were compared with previously generated Illumina data. Horizontal coverage across MS4A1, CD19, and CD22 obtained with ONT was similar to that of Illumina in coding regions, with greater variability in intronic and 3'UTR regions. Despite ONT sequencing depths approximately 3–5 times lower, global gene expression profiles showed high correlation between platforms (r >0.7 after outliers removal), indicating strong consistency in transcriptomic profiles. This concordance was also reflected in molecular subtyping, where both technologies assigned the same subtype to each sample (Ph-like, PAX5alt). However, differences were observed in the quantification of individual isoforms between platforms, including changes in the predominant isoforms of MS4A1 and CD19. Isoform quantification based on long reads varied depending on the computational tool employed, highlighting the need for standardized methodologies for analyses focused on specific isoforms. Amplicon sequencing enabled the detection of an MS4A1 isoform (ENST00000528313.1) lacking the exon encoding the rituximab-binding epitope, which had not been captured in the whole-transcriptome dataset, and whose presence in the samples was validated by RT-PCR. The set of novel isoforms identified showed limited overlap between the two tools used. In silico structural prediction of the most abundant novel MS4A1 isoform identified by FLAIR indicated a truncated protein lacking the entire extracellular portion containing the rituximab epitope. We report the first application of full-transcriptome long-read sequencing using ONT for pediatric B-ALL samples in Argentina. The high variability observed between bioinformatic tools underscores the need to standardize analysis pipelines to ensure reproducibility. This work establishes a methodological foundation for prospectively evaluating the association between transcript isoform profiles and the response to rituximab plus chemotherapy in the multicentric ALLIC-BFM-2022 clinical trial and contribute to the implementation of new technologies for ALL subtype classification in Argentina.
Citación:
---------- APA ----------
Viappiani, Lucila. (2025). Caracterización de la heterogeneidad transcripcional de targets terapéuticos en leucemia linfoblástica aguda pediátrica mediante secuenciación de lectura larga. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001862_Viappiani
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Viappiani, Lucila. "Caracterización de la heterogeneidad transcripcional de targets terapéuticos en leucemia linfoblástica aguda pediátrica mediante secuenciación de lectura larga". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001862_Viappiani
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