Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Estudio de factores que regulan la expresión de mitofusina 2 y sus efectos sobre la biogénesis mitocondrial en células adrenocorticales humanas |
| Título alternativo: | Study of factors regulating mitofusin 2 expression and its effects on mitochondrial biogenesis in human adrenocortical cells |
| Autor: | Arona, Fabrizio Gonzalo |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED)
|
| Publicación en la web: | 2026-07-08 |
| Fecha de defensa: | 2025-08-19 |
| Fecha en portada: | Julio 2025 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental |
| Director: | Poderoso, Cecilia |
| Jurado: | Chertoff, Mariela Sandra Juana; Zarate, Sandra Cristina; Duarte, Alejandra Beatriz |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001838_Arona |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001838_Arona.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001838_Arona |
| Ubicación: | BIO 001838 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Arona, Fabrizio Gonzalo. (2025). Estudio de factores que regulan la expresión de mitofusina 2 y sus efectos sobre la biogénesis mitocondrial en células adrenocorticales humanas. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001838_Arona |
Resumen:
La mitocondria es una organela dinámica que responde ante fluctuaciones en la demanda metabólica celular, pudiendo cambiar su forma, número e inclusive su distribución intracelular. Estos cambios son consecuencia de la actividad de diferentes procesos como fusión, fisión y remodelación mitocondrial, conocidos como dinámica mitocondrial. La maquinaria de fusión mitocondrial involucra las GTPasas Mitofusinas 1 y 2 (Mfn1 y Mfn2), ubicadas en la membrana mitocondrial externa (MME), y la Optic Atrophy 1 (OPA1), ubicada en la membrana mitocondrial interna (MMI). Resulta sumamente interesante el estudio de la regulación del gen MFN2 dado que, además de su bien conocido rol en la fusión mitocondrial, también se ha demostrado que tiene un rol en la función mitocondrial, bioenergética y la biogénesis de mitocondrias. Más aún, la disminución en la expresión o actividad de Mfn2 se ha observado en numerosas patologías como la diabetes tipo 2, obesidad, enfermedades neurodegenerativas (Parkinson y Marie-Charcot-Tooth) y en desórdenes proliferativos vasculares. La Mfn2 está relacionada con diversas funciones celulares como metabolismo oxidativo, ciclo celular, muerte celular y transporte axonal de mitocondrias, al igual que con alteraciones en la proliferación vascular. Mfn2 ejerce un rol positivo en la respiración mitocondrial y en la fosforilación oxidativa (OXPHOS) en fibroblastos murinos. Se ha demostrado que la expresión de Mfn2 está disminuida en varios tipos de tumores malignos humanos, incluidos cáncer gástrico, hepatocelular, colorrectal, de vejiga y cáncer de mama, en los cuales tiene una función anti proliferativa y pro apoptótica. Estudios de nuestro laboratorio han demostrado que la expresión de Mfn2 se encuentra regulada por la estimulación hormonal en células de Leydig de ratón y células adrenocorticales humanas, lo cual favorece la fusión mitocondrial. La expresión regulada de Mfn2 está, al menos en parte, mediada por el factor de transcripción ERRα. Existen trabajos que describen la regulación del promotor de Mfn2 por diferentes factores de transcripción, como el mencionado ERRα, y en particular, el promotor presenta numerosos sitios de reconocimiento para el factor Sp1 (Specificity protein 1), lo cual sugiere la importancia de este factor en la regulación de la expresión de Mfn2. Especialmente, Sp1 es un factor clave en la producción de esteroides en células adrenocorticales. Para entender mejor los mecanismos que regulan la expresión de Mfn2, es necesario estudiar la actividad de su promotor e identificar los elementos que la controlan. Para ello, en este trabajo de Tesina estudiamos la regulación del promotor de Mfn2 por Sp1 en células adrenocorticales humanas H295R en condiciones basales y estimuladas, mediante el uso de un plásmido de expresión de ARN de interferencia contra Sp1 (shARN-Sp1) e incubando tanto con angiotensina II como con 8Br-AMPc. Observamos que una disminución de la expresión del factor Sp1 en células H295R correlaciona con una disminución de la expresión de Mfn2 tanto a nivel del ARNm como de la proteína, tanto a nivel basal como en condiciones de estimulación hormonal por Ang II y por 8Br-AMPc. Con el fin de caracterizar funcionalmente secuencias claves en el promotor de Mfn2 y profundizar en el análisis de la regulación por Sp1, utilizamos un plásmido ya disponible en el laboratorio, conteniendo un fragmento de 1,9 kb que incluía al exón 1 en la secuencia del promotor. Mediante experimentos de transfección y análisis de la quimioluminiscencia, hemos determinado que la estimulación con angiotensina II favorece la actividad de este promotor de largo completo. Luego, utilizamos plásmidos ya existentes conteniendo deleciones unidireccionales a partir del promotor de largo completo y hemos determinado que la pérdida del sitio de reconocimiento de ERRα provoca una disminución de la actividad del promotor, mientras que la pérdida de los sitios de Sp1 produce una reducción significativa en la actividad, en comparación con la secuencia de largo completo, efecto que se reproduce al silenciar Sp1. Estos resultados sugieren que efectivamente los sitios de reconocimiento de Sp1 participan en la mayor actividad del promotor de Mfn2 en esta línea celular H295R. Dado que previamente demostramos que la angiotensina II promueve el aumento de la bioenergética mitocondrial en células adrenocorticales humanas H295R; en este trabajo estudiamos si la Mfn2 tiene un rol en la función respiratoria mitocondrial, a través del análisis de algunos factores de transcripción involucrados en este proceso, como NRF-1 y TFAM. Para abordar este objetivo, utilizamos un plásmido conteniendo un ARN de interferencia para Mfn2 ya presente en el laboratorio. Hemos determinado que el silenciamiento de la expresión de Mfn2 provoca una disminución en los niveles proteicos de NRF-1 y de TFAM, tanto en condiciones basales como al estimular hormonalmente.En conclusión, en este trabajo de Tesina hemos demostrado por primera vez un rol regulador del factor de transcripción Sp1 sobre la expresión de Mfn2 en células adrenocorticales humanas H295R, con una probable implicancia sobre la fusión mitocondrial y la producción de esteroides. Además, hemos observado que la expresión de Mfn2 es necesaria para mantener los niveles de NRF-1 y TFAM, sugiriendo un rol de la Mfn2 en la biogénesis mitocondrial, abriendo la alternativa de estudio de los mecanismos moleculares involucrados en este proceso.
Abstract:
Mitochondria are dynamic organelles that respond to fluctuations in cellular metabolic demand, changing their shape, number and even their intracellular distribution. These changes are the result of various processes such as fusion, fission and mitochondrial remodeling, known as mitochondrial dynamics. The mitochondrial fusion machinery involves the GTPases Mitofusin 1 and 2 (Mfn1 and Mfn2), located in the outer mitochondrial membrane (OMM), and Optic Atrophy 1 (OPA1), located in the inner mitochondrial membrane (IMM).The study of MFN2 gene regulation is extremely interesting because, in addition to its well-known role in mitochondrial fusion, it has also been shown to play a role in mitochondrial function, bioenergetics and mitochondrial biogenesis. Furthermore, decreased expression or activity of Mfn2 has been observed in numerous pathologies such as type 2 diabetes, obesity, neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Marie-Charcot-Tooth, and vascular proliferative disorders. Mfn2 is related to various cellular functions such as oxidative metabolism, cell cycle, cell death and axonal transport of mitochondria, as well as alterations in vascular proliferation. Mfn2 plays a positive role in mitochondrial respiration and oxidative phosphorylation (OXPHOS) in murine fibroblasts. It has been shown that Mfn2 expression is decreased in several types of human malignant tumors, including gastric, hepatocellular, colorectal, bladder and breast cancer, in which it has an antiproliferative and proapoptotic function. Studies from our laboratory have shown that Mfn2 expression is regulated by hormonal stimulation in mouse Leydig cells and human adrenocortical cells, promoting mitochondrial fusion. The regulated expression of Mfn2 is, at least partially, mediated by the transcription factor ERRα. There are studies that describe the regulation of the Mfn2 promoter by different transcription factors, such as the ERRα factor, and in particular, the promoter has numerous recognition sites for the Sp1 (Specificity protein 1) factor, which suggests the importance of this factor in the regulation of Mfn2 expression. Sp1 is a key factor in steroid production in adrenocortical cells. To better understand the mechanisms that regulate Mfn2 expression, it is necessary to study the activity of its promoter and identify the elements that control it. To this end, in this thesis we studied the regulation of the Mfn2 promoter by Sp1 in human H295R adrenocortical cells under basal and stimulated conditions, using an interference RNA expression plasmid against Sp1 (shRNA-Sp1) and incubating with both angiotensin II and 8Br-cAMP. We observed that a decrease in Sp1 factor expression in H295R cells correlates with a decrease in Mfn2 expression at both the mRNA and protein levels, both at baseline and under conditions of hormonal stimulation by Ang II and 8Br-cAMP. To functionally characterize key sequences in the Mfn2 promoter and further analyze Sp1 regulation, we used a plasmid already available in the laboratory containing a 1.9 kb fragment, including exon 1 with the promoter sequence. Through transfection experiments and chemiluminescence analysis, we have determined that stimulation with angiotensin II promotes the activity of this full-length promoter. We then used existing plasmids containing unidirectional deletions from the full-length promoter and determined that the loss of the ERRα recognition site causes a decrease in promoter activity, while the loss of Sp1 sites produces a significant reduction in activity compared to the full-length sequence, an effect that is replicated when Sp1 is silenced. These results suggest that Sp1 recognition sites participate in the increased activity of the Mfn2 promoter in this H295R cell line. Since we previously demonstrated that angiotensin II promotes increased mitochondrial bioenergetics in human H295R adrenocortical cells, in this study we investigated whether Mfn2 plays a role in mitochondrial respiratory function by analyzing some transcription factors involved in this process, such as NRF-1 and TFAM. To address this objective, we used a plasmid containing an interference RNA for Mfn2. We have determined that silencing the expression of Mfn2 causes a decrease in the protein levels of NRF-1 and TFAM, both at baseline and when hormonally stimulated. In conclusion, in this thesis we have demonstrated for the first time a regulatory role of the transcription factor Sp1 on the expression of Mfn2 in human adrenocortical H295R cells, with a probable implication on mitochondrial fusion and steroid production. Furthermore, we have observed that Mfn2 expression is necessary to maintain NRF-1 and TFAM levels, suggesting a role for Mfn2 in mitochondrial biogenesis and opening the possibility of studying the molecular mechanisms involved in this process.
Citación:
---------- APA ----------
Arona, Fabrizio Gonzalo. (2025). Estudio de factores que regulan la expresión de mitofusina 2 y sus efectos sobre la biogénesis mitocondrial en células adrenocorticales humanas. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001838_Arona
---------- CHICAGO ----------
Arona, Fabrizio Gonzalo. "Estudio de factores que regulan la expresión de mitofusina 2 y sus efectos sobre la biogénesis mitocondrial en células adrenocorticales humanas". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001838_Arona
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