Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Efecto de eritropoyetina en la regulación de hepcidina en un ambiente proinflamatorio y de hipoxia en macrófagos |
| Título alternativo: | Effect of erythropoietin on hepcidin regulation in a proinflammatory and hypoxic environment in macrophages |
| Autor: | Gómez Romano, Ailén Macarena |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
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| Publicación en la web: | 2026-07-08 |
| Fecha de defensa: | 2025-07-31 |
| Fecha en portada: | Junio 2025 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Biológica |
| Director: | Chamorro, María Eugenia |
| Director Asistente: | Maltaneri, Romina Eugenia |
| Jurado: | Chaufan, Rosa Gabriela; Martini, Claudia Noemí; Porte Alcon, Soledad |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001829_GomezRomano |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001829_GomezRomano.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001829_GomezRomano |
| Ubicación: | BIO 001829 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Gómez Romano, Ailén Macarena. (2025). Efecto de eritropoyetina en la regulación de hepcidina en un ambiente proinflamatorio y de hipoxia en macrófagos. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001829_GomezRomano |
Resumen:
El hierro (Fe) es un elemento esencial para la supervivencia celular. La disponibilidad de este nutriente está finamente regulada en los organismos, dado que es altamente reactivo y en altas concentraciones resulta tóxico. La Hepcidina (Hep) es la principal hormona reguladora del Fe. Esta hormona es expresada en mayor medida por los hepatocitos del hígado y en menor medida por macrófagos. La Hep actúa sobre la Ferroportina (FPN), el único canal exportador de hierro conocido en mamíferos, impidiendo la exportación de Fe por oclusión y provocando su internalización y posterior degradación. La expresión de HAMP, el gen que codifica a la Hep, está regulada por distintos factores como el Fe plasmático, la hipoxia y citoquinas inflamatorias. La Eritropoyetina (Epo) es una hormona peptídica secretada por los riñones en respuesta a bajos niveles de oxígeno tisular. Esta hormona es necesaria en el proceso de eritropoyesis, dado que previene la apoptosis y promueve la diferenciación y proliferación de los progenitores eritroides en la médula ósea. Durante la eritropoyesis, el Fe es indispensable para la maduración de progenitores eritroides, ya que se requiere para la síntesis de hemoglobina (Hb). La Hb es la proteína encargada de transportar oxígeno a todos los tejidos del organismo, y representa el 80% del Fe total en el cuerpo humano. Los altos niveles de Epo se asocian a una menor expresión de Hep, lo que aumenta la disponibilidad del Fe para abastecer la demanda eritropoyética. El descubrimiento de su receptor (EpoR) en otros tejidos ha llevado a laexploración de sus variadas funciones. En la regulación de los niveles del Fe, los macrófagos desempeñan un papel fundamental en su reciclaje. Estas células del sistema inmune, presentes en todos los tejidos del organismo, participan en la respuesta inmunitaria y en la eliminación de células senescentes, envejecidas o muertas. En particular, los macrófagos fagocitan y degradan glóbulos rojos envejecidos o dañados en el bazo, lo que permite la recuperación de sus componentes, entre ellos, el Fe. Cabe resaltar, que los macrófagos EpoR mediadores de la vía de señalización de Epo, por lo que podrían responder a esta hormona. Considerando esta evidencia, surgió la hipótesis de este trabajo: La Epo modula la expresión de Hep en macrófagos, y dicha regulación se ve modificada según el contexto fisiológico. Con el objetivo de ampliar los conocimientos acerca de la homeostasis del Fe, este trabajo se propuso investigar la mencionada regulación en un ambiente proinflamatorio y de hipoxia. El modelo experimental utilizado fueron células THP-1 diferenciadas en macrófagos. La diferenciación se realizó por exposición a 100 nM de 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) durante 48h. Se determinó la concentración de PMA a utilizar analizando la morfología celular por microscopía óptica, el crecimiento celular por exclusión del colorante supravital y la expresión de marcadores de superficie específicos de macrófagos, CD14 y CD64, por citometría de flujo. Se determinó por RT-PCR y RT-qPCR, que los niveles de ARNm de Hep disminuyeron en presencia de Epo. Con el fin de analizar si este efecto se mantiene en condiciones de inflamación o hipoxia, se expuso a la línea celular THP-1 diferenciadas a macrófagos a la citoquina proinflamatoria interleuquina 6 (IL-6) y a cloruro de cobalto (CoCl2), respectivamente. Se determinó la concentración de IL-6 adecuada para generar un ambiente inflamatorio. Para esto, se midieron los niveles de expresión de ARNm de Hep y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) frente a distintas concentraciones de IL-6. Se estableció que 10ng/mL de IL-6 era la concentración óptima a utilizar, dado que en estas condiciones se detectó el mayor nivel en la expresión de Hep y de generación de ROS con respecto al tratamiento control. Luego, se analizó el efecto de Epo en estas condiciones. Las células THP-1, previamente diferenciadas a macrófagos, fueron expuestas a la concentración seleccionada de IL-6, y posteriormente fueron incubadas en presencia de Epo. Se evaluaron los niveles de ARNm de Hep por RT-PCR, en donde no se detectó un cambio significativo en la expresión de Hep en un ambiente proinflamatorio en presencia de Epo, en comparación al tratamiento correspondiente a IL-6. El paso siguiente fue determinar una concentración de CoCl2 que permitiera simular un ambiente de hipoxia. Las células THP-1 diferenciadas a macrófagos fueron expuestas a distintas concentraciones de CoCl2. Se estableció que 100 μM de CoCl2 era la concentración más adecuada a utilizar. A dicha concentración se detectó por RT-PCR una menor expresión en los niveles de ARNm de Hep, y por Western blotting un aumento en los niveles de la proteína HIF-1α, cuya actividad es inducible por hipoxia. Las células diferenciadas fueron expuestas a estas concentraciones de CoCl2 y posteriormente a Epo. Los resultados obtenidos mostraron una disminución significativa en los niveles de ARNm de Hep en presencia de Epo y CoCl2 por separado, y estos resultados fueron aún menores en presencia de ambos. En conjunto, estos hallazgos muestran que la Epo, genera una disminución de la expresión de Hep, y esta modulación es diferencial tanto en un ambiente proinflamatorio o de hipoxia química. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis sugieren que los macrófagos no solo participan activamente en el reciclado del Fe, sino que también podrían responder funcionalmente a estímulos eritropoyéticos, adaptando su comportamiento en función del contexto fisiológico o patológico. En particular, condiciones como la hipoxia o la inflamación sistémica parecen modular su actividad, afectando tanto la liberación de Fe reciclado como la expresión de genes clave involucrados en la homeostasis férrica, como hepcidina. Esta plasticidad funcional posiciona a los macrófagos como un eslabón dinámico en el eje regulador entre la demanda eritropoyética y la disponibilidad sistémica de Fe.
Abstract:
Iron (Fe) is an essential element for cell survival. The availability of this nutrient is finely regulated in organisms, as it is highly reactive and toxic at high concentrations. Hepcidin (Hep) is the main hormone that regulates Fe levels. This hormone is primarily expressed by hepatocytes in the liver, and to a lesser extent by macrophages. Hep acts on Ferroportin (FPN), the only known Fe exporter in mammals, leading to its occlusion, which blocks Fe export, followed by its internalization and degradation. The expression of HAMP, the gene encoding Hep, is regulated by several factors such as plasma Fe levels, hypoxia, and inflammatory cytokines. Erythropoietin (Epo) is a peptide hormone secreted by the kidneys in response to low tissue oxygen levels. This hormone is essential for the process of erythropoiesis, as it prevents apoptosis and promotes the differentiation and proliferation of erythroid progenitor cells in the bone marrow. During erythropoiesis, Fe is indispensable for the maturation of these progenitors, as it is required for hemoglobin (Hb) synthesis. Hemoglobin, the protein responsible for transporting oxygen to all tissues in the body, accounts for approximately 80% of total body Fe. High levels of Epo are associated with reduced Hep expression, increasing iron availability to meet the demands of erythropoiesis. The discovery of its receptor (EpoR) in other tissues has led to the exploration of its additional functions. Macrophages play a fundamental role in Fe homeostasis by participating in Fe recycling. These immune cells, present in all body tissues, are involved in immune responses and the clearance of senescent, aged, or dead cells. In particular, macrophages phagocytose and degrade aged or damaged red blood cells in the spleen, allowing for the recovery of their components, including Fe. Notably, ophages express EpoR and downstream effectors of the Epo signaling pathway, suggesting they may respond to this hormone. Based on this evidence, the hypothesis of this study emerged: Erythropoietin (Epo) modulates Hepcidin (Hep) expression in macrophages, and this regulation is influenced by the physiological context. In order to further understand Fe homeostasis, this work aimed to investigate this regulation under proinflammatory and hypoxic conditions. The experimental model used were THP-1 cells differentiated into macrophages. Differentiation was induced by exposure to 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for 48 h. The PMA concentration was determined by analyzing cell morphology through optical microscopy, cell growth using supravital dye exclusion, and the expression of macrophage-specific surface markers CD14 and CD64 by flow cytometry. Hep mRNA levels were measured by RT-PCR and RT-qPCR, and were found to decrease in the presence of Epo. To assess whether this effect is maintained under inflammatory or hypoxic conditions, THP-1- derived macrophages were exposed to the proinflammatory cytokine interleukin-6 (IL-6) and to cobalt chloride (CoCl2), respectively. The appropriate concentration of IL-6 to induce an inflammatory environment was determined by measuring Hep mRNA expression and the generation of reactive oxygen species (ROS) in response to various IL-6 concentrations. It was established that 10 ng/mL of IL-6 was optimal, as it led to the highest levels of both Hep expression and ROS generation compared to control treatment. The effect of Epo was then analyzed under these conditions. THP-1-derived macrophages were exposed to IL-6 and then incubated in the presence of Epo. Hep mRNA levels were evaluated by RT-PCR, and no significant changes were observed in Hep expression in the proinflammatory environment with Epo compared to IL-6 treatment alone. Next, the appropriate CoCl2 concentration to simulate a hypoxic environment was determined. THP-1-derived macrophages were exposed to different CoCl2 concentrations. A concentration of 100 μM CoCl2 was found to be optimal. At this concentration, RT-PCR showed a decrease in Hep mRNA expression, and Western blotting detected an increase in HIF-1α protein levels, whose activity is induced by hypoxia. Differentiated cells were then exposed to this concentration of CoCl2, followed by treatment with Epo. The results showed a significant reduction in Hep mRNA levels with both Epo and CoCl2 individually, and an even greater decrease when both were applied together. Taken together, these findings show that Epo reduces Hep expression, and this modulation differs depending on whether the environment is proinflammatory or chemically hypoxic. The results of this thesis suggest that macrophages not only actively participate in Fe recycling, but may also functionally respond to erythropoietic stimuli, adapting their behavior according to physiological or pathological contexts. Specifically, conditions such as hypoxia or systemic inflammation appear to modulate their activity, affecting both recycled Fe release and the expression of key genes involved in iron homeostasis, such as hepcidin. This functional plasticity positions macrophages as a dynamic link in the regulatory axis between erythropoietic demand and systemic Fe availability.
Citación:
---------- APA ----------
Gómez Romano, Ailén Macarena. (2025). Efecto de eritropoyetina en la regulación de hepcidina en un ambiente proinflamatorio y de hipoxia en macrófagos. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001829_GomezRomano
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Gómez Romano, Ailén Macarena. "Efecto de eritropoyetina en la regulación de hepcidina en un ambiente proinflamatorio y de hipoxia en macrófagos". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001829_GomezRomano
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