Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Interacciones moleculares en condensados transcripcionales del receptor de glucocorticoides por microscopía hiperespectralral |
| Título alternativo: | Molecular interactions in transcriptional condensates of the glucocorticoid receptor by hyperspectral microscopy |
| Autor: | Vázquez Lareu, Alejo |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN)
|
| Fecha de defensa: | 2025-03-21 |
| Fecha en portada: | marzo 2025 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Química Biológica |
| Director: | Levi, Valeria |
| Director Asistente: | Presman, Diego Martín |
| Jurado: | Grecco, Hernán Edgardo; Caramelo, Julio Javier; Durrieu, Lucía |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001811_VazquezLareu |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001811_VazquezLareu.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001811_VazquezLareu |
| Ubicación: | Dep.BIO 001811 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Vázquez Lareu, Alejo. (2025). Interacciones moleculares en condensados transcripcionales del receptor de glucocorticoides por microscopía hiperespectralral. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001811_VazquezLareu |
Resumen:
La microscopía espectral es una herramienta que puede proveer información muy relevante y cuantitativa de procesos biológicos en células vivas. Esta microscopía permite detectar y separar la emisión de distintos fluoróforos, lo cual posibilita visualizar múltiples moléculas de interés biológico en forma simultánea y estudiar las interacciones entre las mismas. En este trabajo, optimizamos la adquisición de imágenes espectrales y su análisis por deconvolución tradicional o por diagrama de fasores, una metodología novedosa que no necesita de un ajuste o modelo previo para separar la emisión de los fluoróforos. Posteriormente, analizamos el uso de estas metodologías para el estudio de interacciones inter-moleculares en células vivas, mediante determinaciones de transferencia de energía por el mecanismo de Förster (FRET). En una primera etapa, utilizamos el receptor de glucocorticoides (GR) como modelo de estudio, un factor de transcripción que se activa por ligando, forma homo-oligómeros, e interacciona con coactivadores como NCoA2. Como punto de partida, estudiamos muestras patrón de los fluoróforos CFP y YFP, con las cuales verificamos la correcta adquisición de imágenes espectrales y su análisis para la cuantificación de la eficiencia aparente de FRET. Posteriormente, estudiamos, por un lado, la homodimerización del GR en células coexpresando GR-CFP y GR-YFP, y, por otro lado, la interacción del GR y NCoA2, utilizando el par GFP- JF549. JF549 es un fluoróforo orgánico, ligando en el sistema de marcación HaloTag, que tiene alto brillo molecular y fotoestabilidad, pero su aplicación a estudios de interacción entre proteínas por FRET ha sido poco estudiada hasta el momento. Si bien no logramos detectar FRET en células coexpresando GR-CFP y GR-YFP, o NCoA2-GFP y GR-Halo marcado con JF549, la metodología empleada nos permitió determinar la composición relativa GR/NCoA en distintas regiones dentro del núcleo. La posibilidad de adquirir imágenes espectrales con alta resolución temporal y bajo fotodaño celular, nos llevó a extender nuestros estudios a un campo de gran interés en el área. En particular, analizamos la performance de la metodología desarrollada para caracterizar ciertos aspectos del metabolismo de células vivas cuantificando la fluorescencia intrínseca de las coenzimas NADH y FAD a nivel subcelular. En esta segunda etapa, empleamos como modelo células madre embrionarias de ratón y logramos detectar la transición de un metabolismo predominantemente glucolítico a un metabolismo con mayor fosforilación oxidativa, que ocurre durante la diferenciación de células madre. Sorprendentemente, encontramos una organización espacial de las coenzimas que no había sido reportada en la literatura. En síntesis, en esta tesis logramos optimizar la microscopía espectral en nuestro laboratorio, y lo aplicamos de manera exitosa al estudio de ciertos aspectos de los condensados de GR y la diferenciación celular de células embrionarias
Abstract:
Spectral microscopy is a tool that can provide highly relevant and quantitative information about biological processes in living cells. This microscopy technique allows the detection and separation of the emission of different fluorophores, enabling the simultaneous visualization of multiple molecules of biological interest and the study of their interactions. In this work, we optimized the acquisition of spectral images and their analysis using traditional deconvolution or the phasor plot, a novel methodology that does not require prior fitting or modeling to separate the emission of fluorophores. Subsequently, we analyzed the use of these methodologies for studying inter-molecular interactions in living cells through determinations of Förster resonance energy transfer (FRET). In the first part of this work, we used the glucocorticoid receptor (GR) as a model, a ligand-activated transcription factor that forms homo-oligomers and interacts with coactivators such as NCoA2. As a starting point, we studied control samples of the CFP and YFP fluorophores, with which we verified the correct acquisition of spectral images and their analysis for quantifying the apparent FRET efficiency. Later, we studied the homodimerization of GR in cells by co-expressing GR-CFP and GR-YFP; and the interaction between GR and NCoA2 using the GFP-JF549 pair. JF549 is an organic fluorophore commonly used in the HaloTag labeling system, which has high molecular brightness and photostability. Still, its application to protein interaction studies via FRET has been little explored. Although we did not detect a significant FRET signal in cells co-expressing GR-CFP and GR-YFP, or NCoA2-GFP and GR- Halo labeled with JF549, the methodology allowed us to determine the relative composition of GR/NCoA in different regions within the nucleus. The ability to acquire spectral images with high temporal resolution and low cellular photodamage led us to extend our studies to a field of great interest in the area. Specifically, we analyzed the performance of the developed methodology to characterize certain aspects of metabolism in living cells by quantifying the intrinsic fluorescence of the coenzymes NADH and FAD at the subcellular level. In this second part of this work, we used mouse embryonic stem cells as a model. We successfully detected the transition from a predominantly glycolytic metabolism to one with greater oxidative phosphorylation, which occurs during stem cell differentiation. Surprisingly, we found a spatial organization of the coenzymes that had not been previously reported in the literature. In summary, we successfully optimized spectral microscopy in our laboratory and applied it effectively to the study of certain aspects of GR condensates and the cellular differentiation of embryonic cells
Citación:
---------- APA ----------
Vázquez Lareu, Alejo. (2025). Interacciones moleculares en condensados transcripcionales del receptor de glucocorticoides por microscopía hiperespectralral. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001811_VazquezLareu
---------- CHICAGO ----------
Vázquez Lareu, Alejo. "Interacciones moleculares en condensados transcripcionales del receptor de glucocorticoides por microscopía hiperespectralral". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2025.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001811_VazquezLareu
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