Registro:
| Documento: | Tesis de Grado |
| Título: | Caracterización funcional de la molécula Sb4 como potencial análogo de la proteína morfogénica del hueso tipo 4 (BMP4) en células madre pluripotentes inducidas humanas |
| Título alternativo: | Functional characterization of the small molecule Sb4 as a potential analog of Type 4 Bone Morphogenetic Protein (BMP4) in human induced pluripotent stem cells |
| Autor: | Romano Forit, Carolina |
| Editor: | Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |
| Lugar de trabajo: | CONICET - FLENI - Instituto de Neurociencias (INEU)
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| Publicación en la web: | 2025-06-12 |
| Fecha de defensa: | 2024-05-22 |
| Fecha en portada: | Mayo 2024 |
| Grado Obtenido: | Grado |
| Título Obtenido: | Licenciado en Ciencias Biológicas |
| Departamento Docente: | Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular |
| Director: | Camilletti, María Andrea |
| Director Asistente: | Moro, Lucía Natalia |
| Consejero: | Piuri, Mariana |
| Idioma: | Español |
| Formato: | PDF |
| Handle: |
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001715_RomanoForit |
| PDF: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/download/seminario/seminario_nBIO001715_RomanoForit.pdf |
| Registro: | https://bibliotecadigital.exactas.uba.ar/collection/seminario/document/seminario_nBIO001715_RomanoForit |
| Ubicación: | Dep.BIO 001715 |
| Derechos de Acceso: | Esta obra puede ser leída, grabada y utilizada con fines de estudio, investigación y docencia. Es necesario el reconocimiento de autoría mediante la cita correspondiente. Romano Forit, Carolina. (2024). Caracterización funcional de la molécula Sb4 como potencial análogo de la proteína morfogénica del hueso tipo 4 (BMP4) en células madre pluripotentes inducidas humanas. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001715_RomanoForit |
Resumen:
Las células madre pluripotentes poseen una capacidad única para la auto-renovación y la diferenciación hacia todos los linajes celulares del organismo. Particularmente, las células madre pluripotentes inducidas humanas o hiPSCs, que se obtienen a partir de la reprogramación de células somáticas, han demostrado ser de gran utilidad para diversas aplicaciones como el modelado de enfermedades, el desarrollo de terapias regenerativas y el estudio de eventos del desarrollo embrionario. Una familia de proteínas muy relevante en el desarrollo embrionario, particularmente en el proceso de diferenciación celular, es la familia de proteínas morfogenéticas del hueso (BMPs). La misma está estrechamente vinculada a la formación del endodermo y mesodermo, y el desarrollo cardiaco, entre otras instancias. Defectos en las BMPs causan graves patologías y la modulación de su vía señalética es una de las opciones terapéuticas. En este contexto, se han sintetizado BMPs recombinantes (rBMPS) para su uso en la clínica y también en estudios in vitro, sin embargo presentan desventajas importantes como ser altamente costosas, difíciles de sintetizar y de baja estabilidad. Recientes estudios masivos de screening de potenciales análogos de las BMPs permitieron identificar a Sb4, una molécula de bajo peso molecular capaz de activar la vía canónica de señalización de BMPs en células renales humanas y en células epiteliales de ratón. Dado que este efecto no ha sido explorado en hiPSCs, la hipótesis de este trabajo es que Sb4 activa la vía de BMPs de manera similar a rBMP4 y, por lo tanto, puede ser utilizado en su reemplazo para dirigir la diferenciación de hiPSCs hacia linajes celulares derivados del mesodermo y, posteriormente, cardiomiocitos. En primera instancia se evaluó la tolerancia de las hiPSCs a Sb4 al medir su viabilidad luego de 24 horas de tratamiento con concentraciones 0,01-100 μM de Sb4. Para concentraciones entre 0,01 y 50 μM, la viabilidad celular resultó superior al 80%, mientras que una concentración de 100 μM hizo que disminuyera a menos del 30%. Luego, para explorar la capacidad de Sb4 de activar la vía de BMPs dependiente de SMADs, se midió la expresión de SMAD1 y las formas fosforiladas (pSMAD1/5/8) mediante ensayos de Western blot e inmunofluorescencia en hiPSCs tratadas con rBMP4 o con Sb4. Se vio que el tratamiento con rBMP4 aumenta la señal de p-SMAD 1/5/8 en casi 1,5 veces en comparación con el grupo control, de manera concordante con lo reportado en bibliografía. Al utilizar Sb4 en concentraciones 10 o 25 μM no se observó ningún efecto en comparación con la condición de control. Sí se observó un ligero aumento en la señal cuando se aplicó en una concentración de 50 μM, pero el efecto fue menor al observado con rBMP4 y que el reportado para Sb4 en otros tipos celulares. Por otra parte se estudió la expresión de dos genes target de BMP4 ID1 e ID3, y los resultados mostraron un aumento en los niveles de expresión después de un tratamiento de 24 horas con Sb4 10 μM, aunque el efecto fue significativamente menor que el causado por el tratamiento con rBMP4. Para estudiar el uso de Sb4 como reemplazo de rBMP4 en un ensayo de diferenciación de hiPSCs al linaje mesodérmico se llevó adelante un protocolo en que las células son incubadas en un medio definido suplementado con Activina A+rBMP4, o Activina A+Sb4 durante 72 horas. Los análisis de expresión génica por RT-qPCR revelaron una regulación positiva de los genes asociados a mesodermo (TBXT, EOMES, MIXL1) y un grado variable de silenciamiento de los genes de pluripotencia (OCT4, NANOG y SOX2) en ambas condiciones. A partir de estos resultados, se realizó una diferenciación de hiPSCs a cardiomiocitos, utilizando el mismo medio definido que en el experimento anterior y comparando los tratamientos: Activina A (condición control), Activina A+rBMP4 y Activina A+Sb4 durante 72 horas para inducir la diferenciación mesodérmica en una primera instancia, y luego tratamiento con el inhibidor de la vía de Wnt IWR1 durante 12 días para obtener cardiomiocitos. Los resultados del análisis de expresión génica y proteica de los marcadores de cardiomiocitos NKX2.5 y cTNT, y la detección de estructuras contráctiles en los cultivos celulares, muestran que se pueden obtener cardiomiocitos por cualquiera de las tres condiciones, pero, sorprendentemente, la condición menos efectiva fue la del grupo Activina A+rBMP4, mientras que tanto con el control, como con el grupo Activina A+Sb4, se obtuvieron resultados muy similares. En resumen, los resultados de este trabajo sugieren que, en las condiciones evaluadas, Sb4 logra inducir la activación de la vía de BMPs dependiente de SMADs en hiPSCs, aunque menos eficientemente que rBMP4. Queda pendiente expandir las condiciones de investigación y explorar efectos sobre la vía no canónica. En cuanto a su potencial como reemplazo de rBMP4 en la diferenciación de hiPSCs hacia linajes celulares del mesodermo y cardiomiocitos, los datos obtenidos en esta tesis sugieren que puede tener utilidad como alternativa menos costosa a rBMP4, o bien ser empleado en combinación con rBMP4 de manera de disminuir los costos sin comprometer los niveles de respuesta.
Abstract:
Human pluripotent stem cells possess a unique ability for self-renewal and differentiation into all cell lineages of the organism. In particular, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), derived from the reprogramming of somatic cells, have proven to be highly valuable for various applications such as disease modeling, regenerative therapies, and the study of embryonic development events. A family of proteins that was found to be highly relevant in embryonic development, particularly in cell differentiation, is the bone morphogenetic protein (BMP) family. BMPs are closely linked to endoderm and mesoderm formation, as well as cardiac development, among other processes. Defects in BMPs lead to severe pathologies, and modulating their signaling pathway is one possible therapeutic option. In this context, recombinant BMPs (rBMPS) have been synthesized for clinical use and in vitro studies; however, they present significant disadvantages such as being costly, difficult to synthesize, and having low stability. Recent high-throughput screening studies identified Sb4, a low-molecular-weight molecule capable of activating the canonical BMP signaling pathway in human renal cells and mouse epithelial cells. Given that this effect has not been explored in hiPSCs, the hypothesis of this work is that Sb4 activates the BMP pathway similarly to rBMP4 and can therefore be used as a replacement to direct hiPSC differentiation towards mesodermal lineages and later on, cardiomyocytes. First, the tolerance of hiPSCs to Sb4 was evaluated by measuring cell viability after 24 hours of treatment with concentrations of 0.01-100 μM of Sb4. For concentrations between 0.01 and 50 μM, cell viability was over 80%, while a concentration of 100 μM decreased viability to less than 30%. Next, to explore Sb4's capacity to activate the SMAD-dependent BMP pathway, the expression of SMAD1 and phosphorylated forms (pSMAD1/5/8) was measured by Western blot and immunofluorescence assays in hiPSCs treated with rBMP4 or Sb4. Treatment with rBMP4 increased the p-SMAD1/5/8 signal by almost 1.5 times compared to the control group, consistently with literature reports. When using Sb4 at concentrations of 10 or 25 μM, no effect was observed compared to the control condition. A slight increase in the signal was observed at a concentration of 50 μM, but the effect was less than that observed with rBMP4 and those reported for Sb4 in other cell types. Furthermore, the expression of two BMP4 target genes, ID1 and ID3, was studied, and the results showed an increase in expression levels after a 24-hour treatment with 10 μM Sb4, although the effect was significantly lower than that caused by rBMP4 treatment. In order to study the use of Sb4 as a replacement for rBMP4 in a differentiation assay of hiPSCs into the mesodermal lineage, a protocol was carried out where cells were incubated in defined medium supplemented with Activin A+rBMP4 or Activin A+Sb4 for 72 hours. Gene expression analyses by RT-qPCR revealed positive regulation of mesodermal genes (TBXT, EOMES, MIXL1) and variable silencing of pluripotency genes (OCT4, NANOG, SOX2) under both conditions. Based on these results, hiPSCs were differentiated into cardiomyocytes using the same defined medium as in the previous experiment and the following treatments: Activin A (control condition), Activin A+rBMP4, and Activin A+Sb4 for 72 hours to induce mesodermal differentiation initially, followed by treatment with the Wnt pathway inhibitor IWR1 for 12 days to obtain cardiomyocytes. The results of gene and protein expression analyses of cardiomyocyte markers NKX2.5 and cTNT, as well as the detection of contractile structures since day 14, showed that cardiomyocytes can be obtained under any of the three conditions, but surprisingly, the least effective condition was the Activin A+rBMP4 group, while both the control and Activin A+Sb4 groups yielded very similar results. In summary, the results of this work suggest that, under the conditions used in this investigation, Sb4 induces the activation of the SMAD-dependent BMP pathway in hiPSCs to some degree, albeit less efficiently than rBMP4. Further investigation is needed to expand research conditions and explore effects on the non-canonical pathway. Regarding its potential as a replacement for rBMP4 in the differentiation of hiPSCs into mesodermal and cardiomyocyte lineages, the data obtained in this thesis suggest that Sb4 could be useful as a less costly alternative to rBMP4, or used in combination with rBMP4 to reduce costs without compromising response levels.
Citación:
---------- APA ----------
Romano Forit, Carolina. (2024). Caracterización funcional de la molécula Sb4 como potencial análogo de la proteína morfogénica del hueso tipo 4 (BMP4) en células madre pluripotentes inducidas humanas. (Tesis de Grado. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.). Recuperado de https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001715_RomanoForit
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Romano Forit, Carolina. "Caracterización funcional de la molécula Sb4 como potencial análogo de la proteína morfogénica del hueso tipo 4 (BMP4) en células madre pluripotentes inducidas humanas". Tesis de Grado, Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, 2024.https://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO001715_RomanoForit
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